[실험 원리] PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis)

(이 내용은 과거 제가 레포트로 작성했던 내용을 정리한 것입니다. 혹시 레포트 작성을 위해 찾아온 사람들은 무단으로 배끼지 말고 댓글이라도 남겨주시기 바랍니다.)

<목적>

생물을 구성하고 있는 단백질·핵산 등의 많은 분자들은 전기를 띠고 있어서 전기장 속에서 각 분자가 특징적인 이동을 한다. 이러한 성질을 이용해 생물을 구성하고 있는 물질의 분자량 측정, 각 물질의 전기량이나 형태의 차이를 이용한 물질의 분리 등에 전기영동법이 자주 사용되고 있다.

가장 보편적인 전기영동법으로 단백질의 분리에 사용되는 SDS-PAGE를 들 수 있다. 이 방법을 통한 전기장 속에서 단백질의 이동속도는 분자량을 측정하는 데도 흔히 사용된다. 또한 여러 가지 핵산의 크기나 종류의 구별, 정량, 추출한 염기서열 결정 등의 다양한 실험에서 널리 사용되고 있다.

=> 네이버, 엠파스 백과사전

 

<원리>

Acrylamide를 cross-linker(가교제)로 중합한 polyacrylamide gel은 acrylamide와 가교제의 농도 및 비율에 의해 gel내 미세통로의 크기를 조절할 수 있어 다양한 크기의 생체 분자들을 분리할 수 있을 뿐만 아니라 높은 정밀도와 고분해능으로 인해 오래 전부터 단백질, 핵산 등의 분리에 널리 사용돼 왔다.

Polyacrylamide gel은 acrylamide 측쇄 기능기가 N,N'-methylene bisacrylamide와 같은 2개의 기능기를 가지는 화합물에 의해 비가역적으로 중합되어 형성된 polymer이다.

 

polyacrylamide의 형성

 

가교제로는 N,N'-methylene bisacrylamide (bisacrylamide)가 많이 사용되고 있으며, 또는 N,N'-bisacrylcystamine (BAC), N,N'-diallyltartardiamine (DATD), Ethylene diacrylate (EDIA) 등도 특수한 목적으로 사용되기도 한다.

생체물질의 효과적인 분리 범위는 polyacrylamide의 농도와 가교제와의 중합 정도에 의해 결정되며 가교제에 의해 중합되어 생긴 gel은 적절한 강도와 탄성을 유지하고 polypeptide가 통과할 작은 구멍을 형성한다. 이 구멍의 크기는 가교제와 polyacrylamide의 비율이 증가할수록 감소하여 약 1:20 정도에서 가장 작게 된다. 대부분의 polyacrylamide gel은 1:29의 몰 비율로 제조하며 사용하고 있으며 이 비에서 분자량이 3% 정도의 차이가 있는 polypeptide를 분리할 수 있다.

Polyacrylamide gel은 %T와 %C로 표현되는데 %T는 acrylamide와 bisacrylamide의 %중량이며 %C는 가교제인 bisacrylamide의 %중량이다. 따라서 %T와 %C가 커지면 그만큼 미세통로의 크기는 작아지게 되어 작은 물질의 분리에 이용할 수 있게 된다.

Acrylamide의 중합은 ammonium persulfate (APS) 또는 riboflavin의 첨가에 의해 개시된다. APS를 사용하는 경우에는 촉매제로 N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine (TEMED)를 사용하며 TEMED는 persulfate로부터 자유라디칼의 생성을 촉매함으로써 중합을 개시한다. Riboflavin은 광조사(photoactivation)에 의해 자유라디칼을 생성하여 acrylamide의 중합을 개시한다. Polyacrylamide의 중합이 해리된 자유라디칼에 의해 시작되므로 gel용액 내의 산소는 중합반응을 방해하게 되는데 gel용액을 사전에 degassing 해주는 이유이다.

수직용 전기영동 장치

<종류>

Polyacrylamide gel을 사용하는 단백질 전기영동법은 크게 하나의 gel만을 사용하는 연속적 시스템(continuous buffer system)과 buffer조성이 다른 두 개의 겔을 사용하는 불연속적 방법(discontinuous buffer system)이 있다. 연속 시스템은 pH 3~11사이의 완충용액을 한가지 선택하여 gel과 음전극액 내 전해질 조성 및 농도를 동일하게 만들어 전기영동하는 방법이고 불연속 시스템은 흔히 우리가 알고 있는 stacking gel을 사용하는 경우이다. 또한 단백질 전기영동법은 ionic detergent의 사용유무에 따라 dissociating 또는 non-dissociating 법으로 구분하기도 한다. Dissociating법은 sodium dodecyl sulfate (SDS)와 같은 ionic detergent나 수소결합을 끊어주는 urea등을 단백질 시료에 첨가한 후 열을 가해 denature시킨 후 단백질복합체를 개별 단백질로 해리하여 분석하는 방법으로 disufide bond를 해리 시켜주는 reducing agent (b-mecaptoethanol 또는 DTT)의 사용유무에 따라 reducing 또는 non-reducing법으로 구분하기도 한다. Non-dissociating 법은 단백질변성을 주지 않고 단백질 복합체를 단백질의 고유한 전하에 의해서만 분리하는 방법으로 흔히 Native PAGE라고 한다.

- SDS-PAGE

아크릴아마이드 겔에서 단백질의 이동성은 전체전하나 크기 양쪽의 영향을 모두 받는다. 그렇기 때문에 다른 분자량을 갖는 다른 두 단백질이 상대적으로 비슷한 만큼의 전하를 갖는다면 겔 상에서 같은 속도로 움직일 수도 있다. 이러한 이유로 단순히 아크릴아마이드 겔에 단백질 시료를 주입하는 경우에 별다른 정보를 얻지 못하는 결과를 가져올 수도 있다. 또한 보통의 아크릴아마이드 겔에서는 여러 개의 단위체(subunit)로 이루어져 있는 단백질이 각 단위체로 분리되지 않고 하나의 띠로 나타나기 때문에 정확히 몇 개의 단위체로 이루어져 있는지, 각 단위체의 크기는 얼마나 되는지를 잘 알 수 없다.

하지만 음이온성 세척제(anionic detergent)인 sodium dodecyl sulfate (SDS)를 포함하는 아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 상에서 단백질은 각각의 단위체로 분리되어지며 각 단백질의 이동성은 로그함수적 크기로 분자량과 반비례하는 함수관계를 이룬다. 이러한 점 때문에 단백질의 분자량이나 단백질의 단위체를 분석할 때 SDS-PAGE를 널리 사용하게 되었다.

이 방법을 사용하기 위해서는 단백질의 이황화 결합(S-S 결합 ; disulfide bond)을 끊어주기 위하여 시료를 loading하기 전에 SDS와 β-mercaptoethanol 또는 DTT 존재하에서 가열하여 시료를 준비한다. 그리고 SDS-PAGE를 위한 loading 완충용액은 SDS와 β-mercaptoethanol 또는 DTT가 들어있는 SDS-겔 loading 완충용액을 이용한다. 또한 분자량을 알고 있는 단백질을 표시자로 loading하면 시료 단백질의 분자량을 추정해 낼 수 있다.

단백질을 눈으로 확인하기 위하여 쿠마시 블루(coomassie blue)나 실버(silver) 염색 방법을 쓰거나 항체를 이용한다. 쿠마시 블루 염색에 의한 겔 상의 단백질 띠 검출은 염색제(dye)와 단백질 간의 비특이적 결합에 의한 것이며 0.3-1 mg의 단백질까지 인식할 수 있다. 실버 염색은 실버와 단백질 안의 화학잔기 간의 결합에 의한 것으로 2-5 ng 정도의 단백질까지 인식할 수 있다.

연속 완충용액과 불연속 완충용액 시스템을 이용한 원통(rod)형 겔과 판(slab)형 겔

=> 엘피스 바이오텍 - Protocol note

=> Colorado State University - Biomedical Hypertextbooks

(http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/gels/principles.html)

- 2006년 9월 작성